Научно-исследовательская работа «Исследование свойств пептида IPH® — AVN в культурах клеток человека»

В настоящее время изучение свойств пептидов представляет значительный интерес. Пептиды имеют такую же структуру, как и белки, но размер их молекул меньше. Также важно отметить, что короткие пептиды, являясь природными продуктами метаболизма, присутствующими в организме, не могут быть идентифицированы в крови или моче. В этом случае изучение свойств отдельных структур может быть обеспечено только на клеточном уровне.

Пептид IPH® — AVN содержит низкомолекулярный пептид, обладает ангиопротекторными и вазопротекторными свойствами и оказывает нормализующее действие на сосудистую систему.

Экспериментальные исследования показали, что пептид IPH® — AVN регулирует метаболические процессы в сосудах, снижает проницаемость сосудистой стенки, повышает резервные возможности организма, что позволяет прогнозировать эффективность пептида IPH® — AVN для нормализации функций сосудистой системы человека при нарушениях различного происхождения.

Этапы исследования

1 этап

Для оценки цитостатических и ангиопротекторных свойств пептида IPH®-AVN в отношении сосудистой системы мы выбрали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), которые являются плюрипотентными, что означает их способность дифференцироваться во все три первичных зародышевых слоя: эктодерму, энтодерму и мезодерму, из которых в дальнейшем формируются ткани сосудистой системы. Эмбрион человека достигает стадии бластоцисты, из которой получают стволовые клетки, на 5-6 день после оплодотворения.

Гены, ответственные за формирование сосудистой системы, составляют комплекс ACE, AGT, AGTR2, NOS3, MTHFR. Ген ACE (ангиотензин-превращающий фермент — АПФ) картирован в локусе 17q23. Гены AGT и AGTR1, которые кодируют ангиотензиноген и рецептор 1-го типа к ангиотензину II, а продукт гена NOS3 — NO-синтаза — является ключевым ферментом в регуляции тонуса кровеносных сосудов, гладкой мускулатуры сосудистой стенки и тромбообразования. Ген метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) регулирует метаболизм гомоцистеина в клетке. Полиморфизмы генов NOS3 и MTHFR связаны с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям.

Основываясь на этих данных, мы решили изучить активность этого комплекса генов при применении пептида IPH® — AVN.

Мы оценивали экспрессию генов, ответственных за онтогенез сосудистой системы.

2 этап

Вторым этапом экспериментального исследования была оценка маркерных биологически активных молекул методом иммунофлуоресценции с использованием первичных антител к белку VEGF (1:250, Abcam) и белку p53 (1:50, Abcam).

Мы выбрали следующие маркерные биологически активные молекулы:

• VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) — сигнальный белок, вырабатываемый клетками для стимуляции васкулогенеза (формирования эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенеза (роста новых сосудов в существующей сосудистой системе)
• Старение плюрипотентных клеток в культуре связано с повышением активности гена p53. У мышей с мутацией в гене p53 наблюдалась повышенная устойчивость к развитию опухолей в сочетании со снижением продолжительности жизни. Белок p53 играет ключевую роль в эндогенных противоопухолевых механизмах. Белок p53 контролирует течение процессов клеточного цикла, а также отсутствие повреждений в геноме, которые могли бы привести к последующему развитию патологии. Белок p53 является транскрипционным фактором, который служит супрессором злокачественных опухолей путем активации апоптоза в тканях организма. Белок p53 активируется при повреждении ДНК, а также факторами, которые могут привести к таким повреждениям или сигнализировать о старении клетки и нарушениях ее функциональной активности. p53-зависимый апоптоз позволяет избежать накопления мутаций, а когда они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет устранить такие потенциально опасные клетки.

Материалы и методы исследования

Для изучения свойств пептида IPH®-AVN были использованы следующие клеточные культуры из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РККК П):

SC5

• Происхождение: человек, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), бластоциста (5-6 дней роста), полученная в результате ЭКО.
• Морфология: колонии округлых клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением.
• Метод культивирования: монослой; колонии, прикрепленные к митотически инактивированному (митомицином-C) питательному слою мезенхимальных клеток костного мозга эмбриона человека.
• Условия культивирования: среда — Knockout Dulbecco’s modified Eagles medium, сыворотка — Knockout Serum Replacement 20%, другие ингредиенты – NEAA 1%, L-глутамин 2mM, 2-меркаптоэтанол 0.1 mM, bFGF — 8 нг/мл.
• Процедура пересадки: механическое пассирование культуры ЭСК проводили под контролем микроскопа путем разделения колонии на фрагменты с помощью одноразового скальпеля и переноса их на новый слой фидерных клеток; ежедневная смена среды, пересадка каждые 5-6 дней.
• Криоконсервация: среда для роста, 10% ДМСО, 5×10^5 кл/мл в ампуле.
• Жизнеспособность после криоконсервации: 60% (окрашивание трипановым синим на нулевом эпизоде).
• Контроль на контаминацию: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.
• Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.
• Кариология: 2n=46, модальное число хромосом 46 (98.0+0.9 %), нормальный кариотип человека (46, XX), количество полиплоидов (0.2 + 0.2%).

ДНК-профиль (STR):

Amelogenin: X, X
CSF1PO: 12, 13
D13S317: 8, 11
D16S539: 9, 12
D5S818: 9, 11
D7S820: 8,10,12
THO1: 6, 9.3
TPOX: 10, 11
vWA: 17,17

Другие характеристики:

Среднее время удвоения популяции клеток — 28.2 часа.
Иммортализованная линия прошла более 120 удвоений популяции клеток.
Экспрессия поверхностных антигенов, типичных для ЭСК человека: SSEA-4, TRA-1-60 и транскрипционных факторов Oct-4, Nanog.
Способность к спонтанной дифференцировке в производные 3 зародышевых слоя.
Способность образовывать in vivo тератомы, содержащие производные 3 зародышевых слоя.

Методика исследования

Группы для исследования:

Группа 1 – измерение экспрессии молекул до начала исследования (фоновый уровень),
Группа 2 — контроль (добавление питательной среды, инкубация с сывороточным альбумином)
Группа 3 – добавление контрольного пептида Glu-Trp в концентрации 100 микрограмм (мкг)
Группа 4 – добавление пептида IPH®-AVN в концентрации 100 микрограмм (мкг).

В исследовании использовались пептиды IPH®-AVN и Glu-Trp в виде лиофилизированного порошка, которые растворялись в стерильной воде для инъекций в объёме 10 мл до конечной концентрации пептидов 100 мкг.

Как было показано ранее, для большинства диссоциированных клеточных культур наиболее эффективной является концентрация пептида 100 мкг/мл, что основано на многолетнем опыте работы с пептидами.

Для контроля был выбран иммунозащитный пептид Glu-Trp, свойства которого известны и хорошо описаны в литературе Морозова В. Г., Малинина В. В., Линьковой Н. С. и др. в 2013г.

Для измерения уровня экспрессии генов использовали ПЦР-метод с использованием собственных праймеров и реагентов Novocasta, а также наборов моноклональных антител производства фирмы Biosource (Бельгия).

Мазки клеток обрабатывали соответствующими первичными антителами в соответствии со стандартным протоколом:

1. Тройная промывка фосфатно-солевым буфером — FSB (pH = 7,2) в течение 5 минут
2. Пермеабилизация клеток 0,1%-ным раствором Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере в течение 15 минут.
3. Полоскание в трёх сменах воды (в течение 5 минут)
4. Инкубация в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (разбавленный FSB, pH 7,5) в течение 30 минут для блокирования неспецифического связывания.
5. Инкубация с первичными антителами, 60 минут;
6. Полоскание в трёх сменах воды (в течение 5 минут)
7. Инкубация со вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 (1:1000, Abcam), в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
8. Промыть в трёх сменах FSB (в течение 5 минут);
9. окрашивание ядер клеток красителем Hoechst 33258 (Sigma, США) (1:100 от исходного раствора в dH2O) в течение 1 минуты (краситель используется в качестве флуоресцентного маркера ДНК, при связывании с которым его флуоресценция усиливается).
10. Промывка в FSB (в течение 5 минут);
11. упаковка готовых препаратов для микроскопического исследования под покровным стеклом в флуоресцентном препаративном стекле Dako (Dako).

Результаты исследования

Влияние пептида IPH®-AVN на экспрессию генов, ответственных за формирование сосудистой системы

На рисунке 2 показано, что пептид IPH®-AVN значительно повышает экспрессию комплекса генов ACE, AGT, AGTR2, NOS3, MTHFR, отвечающих за нормальное формирование и развитие сосудистой системы, в частности за регуляцию тонуса кровеносных сосудов, гладкой мускулатуры сосудистой стенки и процессов тромбообразования.

Таким образом, из приведённых выше данных видно, что под воздействием пептида IPH®-AVN в культуре клеток человека происходит статистически значимое увеличение экспрессии генов, отвечающих за онтогенез сосудистой системы. 
Эти данные свидетельствуют о том, что пептид IPH®-AVN значительно увеличивает в культуре клеток человека «каскад» сигнальных молекул, необходимых для активации пролиферации и дифференцировки стволовых клеток в клетки сосудистой системы, формирования сосудистой системы, регуляции метаболизма в эпителиальных клетках, регуляции тонуса кровеносных сосудов, гладкой мускулатуры сосудистой стенки и тромбоза.

Влияние пептида IPH®-AVN на экспрессию белка VEGF в культурах клеток человека

На рисунке 3 показано, что использование пептида IPH®-AVN увеличивает экспрессию белка VEGF в 4,5 раза по сравнению с исходным уровнем, что является фактором роста эндотелия сосудов.

Использование пептида IPH®-AVN оказывает ангиопротекторное действие, в частности, индуцирует дифференцировку полипотентных миогенных клеток в направлении нормального формирования сосудистой системы и стимулирует васкулогенез (формирование эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенез (рост новых сосудов в существующей сосудистой системе).

Влияние пептида IPH®-AVN на экспрессию белка p53 в культурах клеток человека

На рисунке 4 показано, что использование пептида IPH®-AVN увеличивает выработку белка p53, который является фактором транскрипции и служит супрессором злокачественных опухолей, активируя апоптоз в тканях организма. Это позволяет сделать вывод о противоопухолевых свойствах исследуемого пептида.

P53-зависимый апоптоз также предотвращает накопление мутаций, а в случае, если они уже возникли, p53-зависимый апоптоз позволяет устранить потенциально опасные для организма клетки, что позволяет сделать вывод о цитопротекторном эффекте исследуемого пептида. 

Данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH®-AVN в отношении клеток сосудистой системы, о чём свидетельствует экспрессия биологических молекул в клеточной культуре.

Заключение

Проведённые исследования подтверждают высокую биологическую активность пептида IPH® — AVN в отношении контроля нормального формирования сосудистой системы у человека на генетическом уровне, согласно экспрессии генов, отвечающих за онтогенез сосудистой системы, за нормальное формирование сосудистой системы, в частности, регулирующих тонус кровеносных сосудов, гладкую мускулатуру сосудистой стенки и процессы тромбообразования.

Пептид IPH®-AVN значительно увеличивает в культуре клеток человека «каскад» сигнальных молекул, который необходим для активации пролиферации и дифференцировки стволовых клеток в клетках сосудистой системы, формирования сосудистой системы, регуляции метаболизма в эпителиальных клетках, регуляции тонуса кровеносных сосудов, гладкой мускулатуры сосудистой стенки и тромбоза.

Применение пептида IPH®-AVN оказывает ангиопротекторное действие, в частности, индуцирует дифференцировку полипотентных миогенных клеток в направлении нормального формирования сосудистой системы и стимулирует васкулогенез (формирование эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенез (рост новых сосудов в существующей сосудистой системе).

Полученные данные свидетельствуют о высокой онкопротекторной активности пептида IPH®-AVN в отношении клеток сосудистой системы, о чём свидетельствует экспрессия биологических молекул в клеточной культуре.